本发明公开了细毡毛忍冬正品药材的鉴定方法:取药材,通过高效液相色谱法进行测定,药材中5-羟基-7,3′,4′-三甲氧基黄酮的含量在0.3%w/w以上。本发明还提供了细毡毛忍冬药材或提取物的检测方法。本发明中,首次在细毡毛忍冬中发现了5-羟基-7,3′,4′-三甲氧基黄酮这一化合物的存在,同时,将该化合物作为鉴定细毡毛忍冬的指标成分,可以将细毡毛忍冬与现行中国药典收载的其他忍冬类药材进行有效区分,为其品质鉴定提供了一种新的方法。
1.细毡毛忍冬药材的检测方法,其特征在于:它是采用HPLC进行的,操作步骤如下:(1)取细毡毛忍冬,粉碎,以60-80%v/v乙醇回流提取,滤过,量取续滤液,加酸水解后,浓缩至干,残渣加甲醇使溶解,定容,即得供试品溶液;(2)以5-羟基-7,xa03′,xa04′-三甲氧基黄酮为对照品,制备对照品溶液;(3)分别将供试品溶液、对照品溶液注入液相色谱仪中,检测,即可,其中,所述高效液相色谱法的色谱条件如下:色谱柱:十八烷基键合硅胶柱流动相:乙腈:0.3-0.5%磷酸=(20-24):(76-80)柱温:25-35°C检测波长:269±2nm。
2.根据权利要求1所述的检测方法,其特征在于:所述流动相为乙腈:0.4%磷酸=22:78;柱温为30°C;检测波长:269nm。
3.根据权利要求1所述的检测方法,其特征在于:所述高效液相色谱法中,供试品溶液的制备方法如下:取细毡毛忍冬,粉碎,以60-80%v/v乙醇回流提取,滤过,量取续滤液,加酸水解后,浓缩至干,残渣加甲醇使溶解,定容,即得供试品溶液。
4.根据权利要求3所述的检测方法,其特征在于:所述乙醇的浓度为70%v/v。
5.根据权利要求3所述的检测方法,其特征在于:加酸水解步骤中,所用酸为盐酸。
6.根据权利要求3或5所述的检测方法,其特征在于:加酸水解的具体操作为:加入1mol/L盐酸,盐酸与续滤液的体积比为5:1,置90°C水浴中加热水解。技术领域
本发明涉及细毡毛忍冬正品药材的鉴定方法。xa0
背景技术
金银花,是一种常用的中药材,能清热解毒、凉散风热。2005年以前,将忍冬科忍冬、红腺忍冬、山银花和毛花柱忍冬均列为金银花的植物来源,造成了金银花一药多源的局面。但从化学成分分析上,作为主要药用成分的木犀草苷,在忍冬中含量比较高,而山银花中含量很少,两者成分差异较大。因此,2005年以后,《中国药典》规定了,忍冬科忍冬的干燥花蕾或初开的花为正品金银花,将其余品种:灰毡毛忍冬、红腺忍冬、华南忍冬、黄褐毛忍冬列为山银花植物来源。自此,由于金银花的来源较少,其售价也逐渐上升;而金银花的其他俗用药源,由于产量较高,成本较低,也就出现了以山银花或其他忍冬科植物来替用的现象。xa0细毡毛忍冬Loniceraxa0similesxa0Hemsl,为川产金银花的主流品种,分布广,资源蕴藏量大据调查,成都荷花池中药材专业市场经销的金银花,四川省内中药店及医疗单位使用的金银花多为南江产金银花(细毡毛忍冬),并销往全国各地。近年来,虽然有不少研究表明,细毡毛忍冬绿药理作用与药典收载金银花品种相当,但目前川银花优势品种细毡毛忍冬仍未入选中国药典,尤其是《中国药典》2010年版,加强了对中药材专属性成分的鉴别及含量测定,而细毡毛忍冬尚缺乏相关的基础研究,这极大的制约了川产金银花资源的利用。xa0为了给细毡毛忍冬的继续使用提供可靠基础,首先需要研究细毡毛忍冬的物质成分和质量指标,然而,目前鲜见对细毡毛忍冬的此类研究。xa0
发明内容
本发明的目的在于提供一种专属性较强的细毡毛忍冬正品药材的鉴定方法。xa0本发明提供了细毡毛忍冬正品药材的鉴定方法,取药材,通过高效液相色谱法进行测定,药材中5-羟基-7,3′,4′-三甲氧基黄酮的含量在0.3%w/w以上。xa0更进一步地,药材中5-羟基-7,3′,4′-三甲氧基黄酮的含量在0.3~1.2%w/w。xa0进一步优选地,药材中5-羟基-7,3′,4′-三甲氧基黄酮的含量在0.36~1.08%w/w。xa0其中,所述高效液相色谱法的色谱条件如下:xa0色谱柱:十八烷基键合硅胶柱xa0流动相:乙腈:0.3-0.5%磷酸=(20-24):(76-80)xa0柱温:25-35°Cxa0检测波长:269±2nm。xa0进一步地,所述流动相为乙腈:0.4%磷酸=22:78;柱温为30°C;检测波长:269nm。xa0其中,所述高效液相色谱法中,供试品溶液的制备方法如下:xa0取细毡毛忍冬,粉碎,以60-80%v/v乙醇回流提取,滤过,量取续滤液,加酸水解后,浓缩至干,残渣加甲醇使溶解,定容,即得供试品溶液。xa0进一步地,所述乙醇的浓度为70%v/v。xa0进一步地,加酸水解步骤中,所用酸为盐酸。xa0进一步优选地,加酸水解的具体操作为:加入1mol/L盐酸,盐酸与续滤液的体积比为5:1,置90°C水浴中加热水解。xa0本发明还提供了细毡毛忍冬药材或提取物的的检测方法,它是采用HPLC进行的,操作步骤如下:xa0(1)取细毡毛忍冬,粉碎,以60-80%v/v乙醇回流提取,滤过,量取续滤液,加酸水解后,浓缩至干,残渣加甲醇使溶解,定容,即得供试品溶液;xa0(2)以5-羟基-7,3′,4′-三甲氧基黄酮为对照品,制备对照品溶液;xa0(3)分别将供试品溶液、对照品溶液注入液相色谱仪中,检测,即可,其中,所述高效液相色谱法的色谱条件如下:xa0色谱柱:十八烷基键合硅胶柱xa0流动相:乙腈:0.3-0.5%磷酸=(20-24):(76-80)xa0柱温:25-35°Cxa0检测波长:269±2nm。xa0本发明中,首次在细毡毛忍冬中发现了5-羟基-7,3′,4′-三甲氧基黄酮这一化合物的存在,同时,将该化合物作为鉴定细毡毛忍冬的指标成分,可以将细毡毛忍冬与现行中国药典收载的忍冬类其他品种进行有效区分,其专属性强,为其品质鉴定提供了一种新的方法。xa0
附图说明
图1xa0xa05-羟基-7,3′,4′-三甲氧基黄酮(5-hydroxyl-7,3",4"-trimethoxyflavone)氢谱图xa0图2xa0xa05-羟基-7,3′,4′-三甲氧基黄酮(5-hydroxyl-7,3",4"-trimethoxyflavone)碳谱图xa0图3流动相为甲醇-0.1%磷酸(70:30)时的液相图谱xa0图4流动相为甲醇-四氢呋喃-水(13:4:11)时的液相图谱xa0图5流动相为乙腈-0.4%磷酸(22:78)时的液相图谱xa0
具体实施方式
实施例1xa0xa05-羟基-7,3′,4′-三甲氧基黄酮的分离鉴定xa0实验所用的细毡毛忍冬药材采购于四川省南江县,经成都中医药大学马逾英教授鉴定,为忍冬科植物细毡毛忍冬Loniceraxa0similisxa0Hemsl。xa0(1)称取细毡毛忍冬Loniceraxa0similesxa0Hemsl的干燥花蕾1.9Kg,用90%、80%、70%的乙醇回流提取,物料比为1∶8,过滤,减压回收乙醇,得浸膏。经测定,该提取物中含有总黄酮3.39%。xa0(2)取上述浸膏,加水配制上柱液,上柱液浓度以生药计为0.10g/ml,上大孔吸附树脂柱,依次用水、浓度为10%、20%、40%、60%、80%、95%V/V的乙醇洗脱,收集95%乙醇部位;xa0(3)取所得乙醇部位,回收溶剂后,上硅胶柱层析(200-300目,350g,柱体积925ml),用环己烷-乙酸乙酯=20∶1~0∶1,乙酸乙酯-甲醇=5∶1~0∶1系统进行梯度洗脱,每流份150ml,收集洗脱液,薄层监测,合并相同流份,取39~59份,回收溶剂后,用甲醇复溶,再上SephadexLH-20凝胶柱,用甲醇洗脱,收集洗脱液,回收溶剂,重结晶,即得5-羟基-7,3′,4′-三甲氧基黄酮(35mg),转移率为0.17%,经HPLC测定,纯度为99.5%。xa0梯度洗脱的条件为:xa0己烷-乙酸乙酯=20∶1(997.5ml),环己烷-乙酸乙酯=10∶1(990ml),环己烷-乙酸乙酯=8∶1(3050ml),环己烷-乙酸乙酯=6∶1(970ml),环己烷-乙酸乙酯=5∶1(1901ml),环己烷-乙酸乙酯=4:1(1855ml),环己烷-乙酸乙酯=3:1(3755ml),环己烷-乙酸乙酯=2:1(1550ml),环己烷-乙酸乙酯=1:1(1960ml),乙酸乙酯(1500ml),乙酸乙酯-甲醇=5:1(2035ml),乙酸乙酯-甲醇=3:1(1430ml),乙酸乙酯-甲醇=2:1(1335ml),乙酸乙酯-甲醇=1:1(1500ml),甲醇(1500ml)。xa0化合物鉴定:xa0所得化合物为黄色粉末,mp167~169°C。TLC紫外灯下显色,喷AlCl₃有黄色荧光,盐酸-镁粉反应为阳性,三氯化铁反应为阳性。由此初步判断为黄酮类或黄酮醇类化合物。xa0ESI-MSxa0m/z:329[M+H]⁺。xa0¹H-NMR(C₅D₅N,400MHz)δ:7.07(1H,s,H-3),6.60(1H,s,H-6),6.73(1H,s,H-8),7.57(1H,s,H-2′),7.06(1H,d,J=8.6Hz,H-5"),7.66(1H,d,J=8.6Hz,H-6′),13.60(1H,s,5-OH),3.82(3H,s,-OCH₃),3.79(3H,s,-OCH₃),3.72(3H,s,-OCH₃)。xa0¹³C-NMR(C₅D₅N,100MHz)δ:164.4(C-2,s),104.9(C-3,d),182.9(C-4,s),162.7(C-5,s),98.8(C-6,d),166.0(C-7,s),93.1(C-8,d),158.2(C-9,s),106.0(C-10,s),123.2(C-1",s),110.0(C-2",d),149.6(C-3",s),153.2(C-4",s),112.20(C-5",d),120.7(C-6",d),56.5(-OCH₃),56.4(-OCH₃),56.2(-OCH₃)。以上数据与文献基本一致,故确定为5-羟基-7,3′,4′-三甲氧基黄酮。xa0ntent="drawing" img-format="jpg" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>化合物VII5-羟基-7,3′,4′-三甲氧基黄酮(5-hydroxyl-7,3",4"-trimethoxyflavone)xa0实施例2xa0xa0本发明细毡毛忍冬正品药材的鉴定方法xa05-羟基-7,3′,4′-三甲氧基黄酮对金葡球菌等具有抗菌作用(邢俊波,等,忍冬花蕾化学成分研究[J].中国新药杂志,2002,11(11):856-859),与细毡毛忍冬抗菌、抗病毒的功效相吻合,是反映其功能主治的有效成分,目前,还未见细毡毛忍冬中含有该化合物的相关报道。xa0为了将细毡毛忍冬同现行中国药典收载的忍冬类其他药用品种区分,同时为了提供一种细毡毛忍冬独有的鉴定方法,本发明采用高效液相色谱法对各种忍冬药用品种进行了5-羟基-7,3′,4′-三甲氧基黄酮的含量测定。xa0(1)供试品溶液的制备:xa0分别取细毡毛忍冬、忍冬、灰毡毛忍冬、黄褐毛忍冬、华南忍冬粉末(过三号筛)约1g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入70%乙醇50ml,称定重量,加热回流提取1小时,放冷,再称定重量,用70%乙醇补足减失的重量,摇匀,滤过。精密量取续滤液20ml,精密加入1mol/L盐酸4ml,置90°C水浴中加热水解2小时,取出,浓缩至干,残渣加甲醇使溶解,定容至1ml,即得各种忍冬药用植物的供试品溶液。xa0(2)对照品溶液的制备:xa0取5-羟基-7,3′,4′-三甲氧基黄酮(实施例1制备,经HPLC检测,纯度为99.5%,加甲醇制备得到对照品溶液。xa0(3)分别将供试品溶液和对照品溶液进行HPLC检测,计算细毡毛忍冬中5-羟基-7,3′,4′-三甲氧基黄酮的含量,色谱条件如下:xa0色谱柱:Diamonsil^TMxa0C₁₈HPLC色谱柱(250×4.6mm,5μm)xa0流动相:乙腈-0.4%磷酸(22:78)xa0流速:1.0ml/minxa0柱温:30°Cxa0进样量:10μlxa0检测波长:269nmxa0在以上选定条件下,5-羟基-7,3′,4′-三甲氧基黄酮和样品中其他组分色谱峰可基本分离,5-羟基-7,3′,4′-三甲氧基黄酮与其相邻色谱峰的分离度大于1.5,峰形对称、尖锐,理论塔板数为6000。考虑到不同仪器、色谱柱的性能可能存在差异,故定理论板数以5-羟基-7,3′,4′-三甲氧基黄酮计应不低于4000。xa0检测结果如下:xa0表1各样品中5-羟基-7,3′,4′-三甲氧基黄酮含量测定结果(n=2)xa0ntent="drawing" img-format="jpg" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>注:“—”表明没检测出。上述实验所用的药材样品,经成都中医药大学马逾英教授鉴定,1~10号样品为忍冬科植物细毡毛忍冬Loniceraxa0similisxa0Hemsl;11~12号样品为忍冬科植物Loniceraxa0japonicaxa0Thunb.;13~14号样品为忍冬科植物灰毡毛忍冬L.macranthoidesxa0Hand.Mazz;15号样品为忍冬科植物黄褐毛忍冬L.fulvotomentosexa0Hsuxa0etxa0S.C.Cheng;16号样品为忍冬科植物华南忍冬Loniceraxa0confusaxa0DC.。xa0上述实验结果表明:xa0(1)通过将细毡毛忍冬与药典品种金银花(忍冬)、山银花(黄褐毛忍冬、灰毡毛忍冬、华南忍冬)对比研究发现,除了细毡毛忍冬和药典品种忍冬外,黄褐毛忍冬、灰毡毛忍冬、华南忍冬中均不含有含5-羟基-7,3′,4′-三甲氧基黄酮;而忍冬中,虽然含有5-羟基-7,3′,4′-三甲氧基黄酮,但该化合物的含量较低,均未达到0.2%。xa0(2)10批细毡毛忍冬的5-羟基-7,3′,4′-三甲氧基黄酮含量最高可达1.08%,最低0.36%,平均为0.68%;各批样品5-羟基-7,3′,4′-三甲氧基黄酮的含量有一定的差异,分析原因,可能与产地、采收时间以及商品药材的储存时间不同有关。xa0根据上述10批数据统计可知,细毡毛忍冬中5-羟基-7,3′,4′-三甲氧基黄酮的含量均在0.3%以上,因此,本发明拟定,将5-羟基-7,3′,4′-三甲氧基黄酮作为鉴定细毡毛忍冬的标准化合物,且,若忍冬类药材中,该化合物含量xa0在0.3%以上时,即可判定该药材为细毡毛忍冬。xa0实施例3xa0xa0细毡毛忍冬药材或提取物的检测方法xa0根据实施例2可知,细毡毛忍冬药材中5-羟基-7,3′,4′-三甲氧基黄酮含量较高,而其他药典收载品种中未含有该类化合物或含量较低,同时,该化合物对金葡球菌等具有抗菌作用,与细毡毛忍冬抗菌、抗病毒的功效相吻合,是反映其功能主治的有效成分,因此,若选择该化合物为指标成分,可在一定程度上反映细毡毛忍冬药材或其提取物的质量高低。xa0综上,本发明通过采用HPLC对细毡毛忍冬药材或提取物进行质量检测,操作步骤如下:xa0(1)取细毡毛忍冬,粉碎,精密加入70%乙醇50ml,称定重量,加热回流提取1小时,放冷,再称定重量,用70%乙醇补足减失的重量,摇匀,滤过;精密量取续滤液20ml,精密加入1mol/L盐酸4ml,置90°C水浴中加热水解2小时,取出,浓缩至干,残渣加甲醇使溶解,定容至1ml,即得供试品溶液。xa0(2)取5-羟基-7,3′,4′-三甲氧基黄酮(实施例1制备,经HPLC检测,纯度为99.5%,加甲醇制备得到对照品溶液。xa0(3)分别将供试品溶液、对照品溶液注入液相色谱仪中,检测,即可,其中,所述高效液相色谱法的色谱条件如下:xa0色谱柱:Diamonsil^TMxa0C₁₈HPLC色谱柱(250×4.6mm,5μm)xa0流动相:乙腈-0.4%磷酸(22:78)xa0流速:1.0ml/minxa0柱温:30°Cxa0进样量:10μlxa0检测波长:269nm。xa0实施例4xa0xa0本发明鉴定方法中高效液相色谱法的方法学考察xa01仪器与试药xa0日本岛津LC-20A型高效液相色谱仪xa0电子分析天平BP121S(北京Sartorius天平有限公司)xa05-羟基-7,3′,4′-三甲氧基黄酮(实施例1方法制备,纯度99.5%,HPLC面积归一法确定)xa0乙腈、甲醇为色谱纯(德国Fisher),水为重蒸馏水,其余试剂均为分析纯。xa02xa0xa05-羟基-7,3′,4′-三甲氧基黄酮的纯度检查xa0TLC法精密称取5-羟基-7,3′,4′-三甲氧基黄酮2.7mg,甲醇溶解,定容至10ml。按照《中国药典》2010版一部(附录VIB)方法实验,分别吸取5μl、10μl、20μl点于同聚酰胺薄膜上,分别用氯仿-甲醇(2∶1)、甲醇-水(4∶1)、75%微乳液-甲酸(9∶1)三种展开系统展开,1%三氯化铝乙醇溶液显色,薄xa0层色谱中均呈单一斑点;在紫外光灯(254nm)下见识,均呈黄绿色荧光斑点。xa0HPLC法精密称取5-羟基-7,3′,4′-三甲氧基黄酮适量,制成每1ml含0.984mg的溶液。取10μl注入高效液相色谱仪,在269nm下检视,未见有杂质峰出现,纯度为99.5%(HPLC面积归一法)。xa03xa0xa0检测波长的选择xa0取5-羟基-7,3′,4′-三甲氧基黄酮对照品用甲醇溶解制成含5-羟基-7,3′,4′-三甲氧基黄酮0.984mg/ml的溶液,另取空白甲醇溶液,于UV-1100型分光光度仪上,在200~800nm波长范围扫描绘制紫外吸收光谱。5-羟基-7,3′,4′-三甲氧基黄酮在269.0nm波长处有一最大吸收峰。xa04xa0xa0流动相的选择xa0分别考察流动相甲醇-0.1%磷酸(70:30)、甲醇-四氢呋喃-水(13:4:11)、乙腈-0.4%磷酸(22:78),色谱图见图3-5。结果表明流动相为乙腈-0.4%磷酸(22:78)时,5-羟基-7,3′,4′-三甲氧基黄酮和样品中其他组分色谱峰可基线分离,出峰时间稳定、合适,故确定乙腈-0.4%磷酸(22:78)为流动相。xa0确定的色谱条件如下:xa0色谱柱:Diamonsil^TMxa0C₁₈HPLC色谱柱(250×4.6mm,5μm)xa0流动相:乙腈-0.4%磷酸(22:78)xa0流速:1.0ml/minxa0柱温:30°Cxa0进样量:10μlxa0检测波长:269nmxa0在以上选定条件下,5-羟基-7,3′,4′-三甲氧基黄酮和样品中其他组分色谱峰可基本分离,5-羟基-7,3′,4′-三甲氧基黄酮与其相邻色谱峰的分离度大于1.5,峰形对称、尖锐,理论塔板数为6000。考虑到不同仪器、色谱柱的性能可能存在差异,故定理论板数以5-羟基-7,3′,4′-三甲氧基黄酮计应不低于4000。xa05xa0xa0线性关系的考察xa0取上述5-羟基-7,3′,4′-三甲氧基黄酮对照品溶液,加甲醇稀释成浓度为0.1968mg/ml的溶液。分别吸取该溶液1μl,5μl,10μl,15μl,20μl,25μl,按上述色谱条件进行色谱分析,测定峰面积。结果见表2。以峰面积为纵坐标,5-羟基-7,3′,4′-三甲氧基黄酮的量为横坐标,绘制标准曲线,得回归方程。xa0表2xa0xa0线性关系考查结果xa0ntent="drawing" img-format="jpg" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>6xa0xa0供试品溶液的制备xa06.1提取溶剂考察xa0分别称取细毡毛忍冬样品4份,每份约1.0g,精密称定,分别加入甲醇、50%乙醇、70%乙醇、90%乙醇50ml,称定重量,回流提取1小时。放冷,再称定重量,分别用相应的溶液补足减失的重量,摇匀,滤过。精密量取续滤液20ml,加入1mol/L盐酸4ml,回流1小时,浓缩至干,残渣加甲醇使溶解,定容至1ml,即得。进样前用0.45μm微孔滤膜过滤,吸取10μl,注入液相色谱仪,照前述色谱条件进行测定,计算峰面积。照此法平行操作两次。结果见表3。xa0表3xa0xa0提取溶剂考察(n=2)xa0ntent="drawing" img-format="jpg" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>以上结果表明,70%乙醇提取所得的5-羟基-7,3′,4′-三甲氧基黄酮含量较高,因此选70%乙醇作为提取溶剂。xa06.2提取方法考察xa0分别称取细毡毛忍冬样品2份,每份约1.0g,精密称定,各加入70%乙醇50ml,称定重量,一份超声提取1小时,一份回流提取1小时。放冷,再称定重量,用70%乙醇补足减失的重量,摇匀,滤过。精密量取续滤液20ml,各加入1mol/L盐酸4ml,回流1小时,浓缩至干,残渣加甲醇使溶解,定容至1ml,即得。进样前用0.45μm微孔滤膜过滤,吸取10μl,注入液相色谱仪,照前述色谱条件进行测定,计算样品中5-羟基-7,3′,4′-三甲氧基黄酮的含量。照此法平行操作两次。结果见表4。xa0表4xa0xa0提取方法考察(n=2)xa0ntent="drawing" img-format="jpg" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>以上结果表明,回流提取方法所得的5-羟基-7,3′,4′-三甲氧基黄酮含量较超声提取高,因此选用回流提取方法。xa06.3提取时间考察xa0分别称取细毡毛忍冬样品3份,每份约1.0g,精密称定,加入70%乙醇50ml,称定重量,分别回流提取1小时、2小时、3小时。放冷,再称定重量,用70%乙醇补足减失的重量,摇匀,滤过。精密量取续滤液20ml,加入1mol/L盐酸4ml,回流1小时,浓缩至干,残渣加甲醇使溶解,定容至1ml,即得。进样前用0.45μm微孔滤膜过滤,吸取10μl,注入液相色谱仪,照前述色谱条件进行测定,计算样品中5-羟基-7,3′,4′-三甲氧基黄酮的含量。照此法平行操作两次。结果见表5。xa0表5xa0xa0提取时间考察(n=2)xa0ntent="drawing" img-format="jpg" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>以上结果表明,提取1小时、2小时、3小时5-羟基-7,3′,4′-三甲氧基黄酮的含量差异不大,综合考虑,确定提取时间为1小时。xa06.4水解酸种类考察xa0分别称取细毡毛忍冬样品3份,每份约1.0g,精密称定,分别加入70%乙醇150ml,称定重量,回流提取1小时。放冷,再称定重量,用70%乙醇补足减失的重量,摇匀,滤过。精密量取续滤液20ml,各加入1mol/L盐酸4ml、1mol/L硫酸4ml、水4ml,回流1小时,浓缩至干,残渣加甲醇使溶解,定容至1ml,即得。进样前用0.45μm微孔滤膜过滤,吸取10μl,注入液相色谱仪,照前述色谱条件进行测定,计算样品中5-羟基-7,3′,4′-三甲氧基黄酮的含量。照此法平行操作两次。结果见表6。xa0表6水解酸种类考察(n=2)xa0ntent="drawing" img-format="jpg" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>注:“-”表明没检测出。xa0以上结果表明,空白对照无5-羟基-7,3′,4′-三甲氧基黄酮色谱峰,加入盐酸水解效果较好,因此选用盐酸水解。xa06.5盐酸浓度考察xa0分别称取细毡毛忍冬样品4份,每份约1.0g,精密称定,分别加入70%xa0乙醇50ml,称定重量,回流提取1小时。放冷,再称定重量,用70%乙醇补足减失的重量,摇匀,滤过。精密量取续滤液20ml,各加入浓度为2mol/L、1mol/L、0.5mol/L、0.25mol/L的盐酸4ml,回流1小时,浓缩至干,残渣加甲醇使溶解,定容至1ml,即得。进样前用0.45μm微孔滤膜过滤,吸取10μl,注入液相色谱仪,照前述色谱条件进行测定,计算样品中5-羟基-7,3′,4′-三甲氧基黄酮的含量。照此法平行操作两次。结果见表7。xa0表7xa0xa0盐酸浓度考察(n=2)xa0ntent="drawing" img-format="jpg" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>以上结果表明,用浓度为0.25mol/L、0.5mol/L的盐酸水解后,供试品所测得5-羟基-7,3′,4′-三甲氧基黄酮含量稍低,用浓度为1mol/L、2mol/L的盐酸水解后含量较高,且二者差异不大,综合考虑,选用1mol/L的盐酸进行水解。xa06.6盐酸加入量考察xa0分别称取细毡毛忍冬样品3份,每份约1.0g,精密称定,分别加入70%乙醇50ml,称定重量,回流提取1小时。放冷,再称定重量,用70%乙醇补足减失的重量,摇匀,滤过。精密量取续滤液20ml,分别按5∶1、10∶1、20∶1的比例加入1mol/L盐酸(即分别加入1mol/L盐酸4ml、2ml、1ml),回流1小时,浓缩至干,残渣加甲醇使溶解,定容至1ml,即得。进样前用0.45μm微孔滤膜过滤,吸取10μl,注入液相色谱仪,照前述色谱条件进行测定,计算样品中5-羟基-7,3′,4′-三甲氧基黄酮的含量。照此法平行操作两次。结果见表8。xa0表8xa0xa0盐酸加入量考察(n=2)xa0ntent="drawing" img-format="jpg" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>以上结果表明,按5∶1比列加入1mol/L盐酸时水解效果较好,结合实际操作,因此按5∶1比列(即4ml)加入1mol/L盐酸水解。xa06.7水解时间考察xa0分别称取细毡毛忍冬样品3份,每份约1.0g,精密称定,分别加入70%乙醇50ml,称定重量,回流提取1小时。放冷,再称定重量,用70%乙醇补足减失的重量,摇匀,滤过。精密量取续滤液20ml,加入1mol/L盐酸4ml,分别回流1小时、2小时、3小时,浓缩至干,残渣加甲醇使溶解,定容至1ml,即得。进样前用0.45μm微孔滤膜过滤,吸取10μl,注入液相色谱仪,照前述色谱条件进行测定,计算样品中5-羟基-7,3′,4′-三甲氧基黄酮的含量。照此法平行操作两次。结果见表9。xa0表9xa0xa0水解时间考察(n=2)xa0ntent="drawing" img-format="jpg" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>以上结果表明,酸水解1小时,供试品所测得5-羟基-7,3′,4′-三甲氧基黄酮含量稍低,水解2小时、3小时的含量较高,且二者差异不大,综合考虑,确定酸水解时间为2小时。xa0根据上述试验结果,确定供试品溶液制备方法:取细毡毛忍冬粉末(过三号筛)约1g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入70%乙醇50ml,称定重量,加热回流提取1小时,放冷,再称定重量,用70%乙醇补足减失的重量,摇匀,滤过。精密量取续滤液20ml,精密加入1mol/L盐酸4ml,置90°C水浴中加热水解2小时,取出,浓缩至干,残渣加甲醇使溶解,定容至1ml,即得。xa07精密度试验xa0精密吸取5-羟基-7,3′,4′-三甲氧基黄酮对照品溶液(0.984mg/ml)10μl,连续进样5次,测定峰面积值,结果见表10。xa0表10xa0xa0精密度考察结果xa0ntent="drawing" img-format="jpg" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>以上结果表明:本方法精密度良好。xa08稳定性试验xa08.1对照品溶液的稳定性xa0精密吸取5-羟基-7,3′,4′-三甲氧基黄酮对照品溶液(0.984mg/ml)10μl,分别在0、4、8、12、24小时测定一次,测定结果见表11。xa0表11对照品溶液的稳定性试验xa0ntent="drawing" img-format="jpg" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>以上结果表明:对照品溶液在24小时内稳定性良好。xa08.2供试品溶液的稳定性xa0取细毡毛忍冬样品约1.0g,精密称定,按供试品制备方法进行处理,即得供试品溶液。按供试品测定方法,分别在0、4、8、12、24小时测定一次,测定结果见表12。xa0表12xa0xa0供试品溶液的稳定性试验xa0ntent="drawing" img-format="jpg" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>测定结果表明:供试品溶液在24小时内基本稳定。xa09重现性试验xa0取细毡毛忍冬样品平行6份,每份约1.0g,精密称定,按照供试品制备方法进行处理,即得供试品溶液。按供试品测定方法,测得样品峰面积,计算5-羟基-7,3′,4′-三甲氧基黄酮的含量,结果见表13。xa0表13xa0xa0供试品溶液的重现性试验(n=6)xa0ntent="drawing" img-format="jpg" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>以上结果表明:本方法测定供试品中5-羟基-7,3′,4′-三甲氧基黄酮含量,重现性良好。xa010加样回收试验xa0采用加样回收率法,分别取已知含量的细毡毛忍冬样品约1.0g,精密称定,各精密加入适量5-羟基-7,3′,4′-三甲氧基黄酮对照品,按样品测定方法操作,测得样品中5-羟基-7,3′,4′-三甲氧基黄酮对照品的含量,计算回收率。结果见表14。xa0表14xa0xa0回收率试验结果(n=9)xa0ntent="drawing" img-format="jpg" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>试验结果表明:结果5-羟基-7,3′,4′-三甲氧基黄酮平均加样回收率为99.98%,RSD=0.96%(n=9),表明在95%~105%之间,本方法回收率良好。xa0通过上述实验可知,本发明鉴定方法所用高效液相色谱法,稳定可靠,重现性良好。xa0本发明中,首次在细毡毛忍冬中发现了5-羟基-7,3′,4′-三甲氧基黄酮这一化合物的存在,同时,将该化合物作为鉴定细毡毛忍冬的指标成分,可以将细毡毛忍冬与现行中国药典收载的其他忍冬类药材进行有效区分,为其品种鉴定提供了一种新的方法。xa0